B
如果用EcoRI对外源DNA和质粒进行酶切，因为粘性末端相同，将多个含有目的基因的DNA片段与多个质粒的酶切产物用DNA连接酶进行连接后，两两连接所形成的产物有空质粒，反向连接的质粒，正向连接的质粒三种，故A正确。如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRI酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRI酶切点有2个，故B错误。为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时应使用双酶切最好，故C正确。用钙离子处理细菌细胞增强其通透性，可以提高转化效率，故D正确。
